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貨號(hào)：SC706011

規(guī)格：50測(cè)試/盒

【產(chǎn)品概述】

支原體形態(tài)多樣，大小介于細(xì)菌和病毒之間，可通過(guò)細(xì)菌濾器，對(duì)一般抗生素不敏感，是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞污染的一種常見(jiàn)微生物。支原體污染細(xì)胞后，通常會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)和功能的改變，且很難被清除。

本試劑盒針基于qPCR技術(shù)，對(duì)支原體屬的保守區(qū)DNA設(shè)計(jì)引物探針，對(duì)樣品中的支原體DNA進(jìn)行定性檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高，特異性好，可檢測(cè)的支原體包括萊氏無(wú)膽甾原體、發(fā)酵支原體、豬鼻支原體、口腔支原體、精氨酸支原體、肺炎支原體、雞毒支原體、滑液支原體、螺原體等共計(jì)百余種支原體。

（圖1 檢測(cè)原理圖）

本試劑盒以DNA探針為底物，當(dāng)檢品中存在核糖核酸酶時(shí)，DNA探針被降解，標(biāo)記在探針上的熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離（詳見(jiàn)圖1），產(chǎn)生熒光，該方法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好及高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)需求自由選擇進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。

【產(chǎn)品特點(diǎn)】

1. 操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，2個(gè)小時(shí)完成檢測(cè)。

2. 適用性廣，可用于各種樣本類型的檢測(cè)（細(xì)菌，細(xì)胞沉淀，培養(yǎng)液，細(xì)胞制品等）

3. 試劑盒包含內(nèi)參，可對(duì)樣本提取至最終上機(jī)的全過(guò)程實(shí)施監(jiān)控，有效預(yù)防假陰性。

4. 檢測(cè)過(guò)程閉管操作，不受環(huán)境因素影響，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性高，無(wú)污染風(fēng)險(xiǎn)。

5. 靈敏度高，針對(duì)下表中的支原體檢測(cè)限低至10 CFU/ml。

6. 支原體種類覆蓋范圍廣，可檢測(cè)120余種支原體。

【支原體介紹】

支原體（Mycoplasma）是一種介于細(xì)菌和病毒之間的原核細(xì)胞型微生物，它沒(méi)有細(xì)胞壁，由胞外結(jié)構(gòu)、單位膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)組成，最早是在1898年由法國(guó)的Nocard及Roux自患牛肺疫的病灶中分離出來(lái)的，1967年被正式命名為支原體。

由于缺乏生物合成和代謝能力的基因，支原體必須依賴宿主細(xì)胞提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，支原體的胞外結(jié)構(gòu)中的莢膜和粘附結(jié)構(gòu)可以幫助其粘附在細(xì)胞表面或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。雖然支原體廣泛存在于自然環(huán)境、人和動(dòng)物體內(nèi)，但只有少數(shù)支原體對(duì)人有致病性。常見(jiàn)的人致病支原體包括肺炎支原體、溶脲脲原體、人型支原體和生殖器支原體等。巨噬細(xì)胞、lgG和IgM等宿主免疫因子可以對(duì)支原體起到一定的殺傷作用。

(圖2 支原體顯微形態(tài))

【生物制品為什么要進(jìn)行支原體檢測(cè)】

（1）細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體感染是一個(gè)普遍存在的問(wèn)題：

支原體是一種廣泛分布于自然環(huán)境中的微生物，其大小一般在0.2-0.5微米之間，可以透過(guò)一般濾膜，因此在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，易造成支原體對(duì)細(xì)胞的感染。自1956年Robinson等首次從三株Hela細(xì)胞培養(yǎng)中分離出支原體以來(lái)，就不斷有關(guān)于支原體污染細(xì)胞的報(bào)道出現(xiàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體感染，95%的污染源來(lái)自口腔支原體（M. orale），精氨酸支原體（M. arginini），發(fā)酵支原體（M. fermentans），豬鼻支原體（M. hyorhinitis）和萊氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii）。

（2）支原體感染的危害：

支原體感染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的改變，影響細(xì)胞的正常生存和功能。嚴(yán)重的情況下，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或生物學(xué)特性的改變。此外，支原體感染會(huì)影響細(xì)胞對(duì)各類激素、藥物和化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)，從而干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

細(xì)胞是制備疫苗的主要載體之一。支原體通過(guò)引起細(xì)胞病變，競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和抑制干擾素分泌等機(jī)制，產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，干擾病毒復(fù)制，這會(huì)極大影響疫苗的產(chǎn)量，并可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制。

此外，在疫苗制造中，常常會(huì)將支原體污染帶來(lái)的干擾誤以為是病毒繁殖造成的病變效應(yīng)，從而導(dǎo)致虛假的效力測(cè)定結(jié)果，影響病毒真正滴度的測(cè)定，使研究結(jié)果的真實(shí)性和可靠性大大存疑。

因此，針對(duì)支原體對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)帶來(lái)的巨大不良影響，在中國(guó)藥典、歐洲藥典、美國(guó)藥典和日本藥典中都要求，對(duì)主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、病毒種子批以及病毒疫苗等均需執(zhí)行支原體檢查。其中歐洲藥典和美國(guó)藥典更是要求樣品首次執(zhí)行支原體檢查或生產(chǎn)流程變更時(shí)需要進(jìn)行干擾性確認(rèn)，以保證支原體檢查結(jié)果的有效性。

【支原體的檢測(cè)方法】

（1）培養(yǎng)法：

通過(guò)提供適合支原體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分，培養(yǎng)支原體。通過(guò)對(duì)液體培養(yǎng)基的顏色、濁度變化，固體培養(yǎng)基和半流體培養(yǎng)基的支原體菌落形態(tài)來(lái)判斷支原體的生長(zhǎng)。

（2）熒光指示細(xì)胞法：

常見(jiàn)的支原體檢測(cè)方法中最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的方法是熒光指示細(xì)胞法。該方法使用的熒光染料是煙酸己可堿，其激發(fā)波長(zhǎng)為350nm（紫外激發(fā)），發(fā)射波長(zhǎng)為420nm。該染料會(huì)結(jié)合到DNA 中富含A-T 的區(qū)域，由于支原體的DNA中A-T 含量占多數(shù)(55%~80%），所以可被染色而檢測(cè)到。支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體DNA，證明該細(xì)胞有支原體污染。熒光指示細(xì)胞法較為快捷，方法簡(jiǎn)單，但其靈敏度有一定的欠缺，易造成漏檢。

（3）掃描電子顯微鏡法：

掃描電子顯微鏡法非常直觀、準(zhǔn)確，對(duì)使用環(huán)境要求高，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，常作為樣品的最后定性檢測(cè)。

（4）免疫熒光法：

免疫熒光試驗(yàn)利用支原體的單克隆抗體和熒光標(biāo)記的二抗識(shí)別樣品中的支原體抗原，通過(guò)熒光顯微鏡判斷是否存在支原體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）同樣也是使用支原體的單克隆抗體，利用抗體上的“標(biāo)簽”蛋白的量來(lái)判斷是否存在支原體。該方法靈敏度較低，對(duì)低濃度樣品容易造成漏檢的情況。

（5）PCR法：

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡(jiǎn)稱，是一種體外擴(kuò)增DNA的技術(shù)。PCR技術(shù)利用DNA聚合酶酶學(xué)原理，通過(guò)一系列的循環(huán)反應(yīng)，將靶DNA模板擴(kuò)增出數(shù)萬(wàn)億份相同的DNA片段，放大檢測(cè)標(biāo)的，達(dá)到特異性檢測(cè)的目的。PCR法檢測(cè)支原體的方法最為快速、靈敏。取樣量少，既可做細(xì)胞本身，也可做細(xì)胞培養(yǎng)液上清的檢測(cè)，同時(shí)可以檢測(cè)多種支原體的污染，是目前常用的檢測(cè)手段，也是歐洲藥典中提到的檢測(cè)方法。

【應(yīng)用場(chǎng)景】

1）抗體藥、疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的支原體檢測(cè)

2）科研實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)的支原體檢測(cè)

【應(yīng)用單位】